循環腫瘤細胞（CTC）是癌症血源性擴散導致遠端轉移發展的主要機制。對CTC的計數和表徵的研究，特別是在過去十年中，已經允許在臨床環境中引入了半自動化的CTC評估。在乳癌中，CTC計數被用作預後生物標誌物，也當作是治療反應的預測生物標誌物，並且正在被評估用以指導癌症早期和轉移性環境中的治療。 CTC的表徵具有指導標靶治療的潛力，例如HER2陰性原發性乳癌患者中的HER2療法。但是，CTC評估仍然存在相當大的挑戰。這些非常罕見的細胞其捕獲和鑑定，目前在很大程度上取決於表型同質性的假設前提。此外，缺乏循環腫瘤細胞有效的高通量測定。所以目前為止， CTC的臨床意義尚不完全清楚。

大部分CTC陽性患者並沒有同時有遠端轉移跡象，所以有學者提出了腫瘤休眠或無活力的CTC的問題。 CTC可能具有額外的臨床病發症，例如促進靜脈血栓形成。然而，CTC也提供腫瘤的即時性液體活檢的機會，並且這可能是代表了評估疾病狀態、且令人興奮的微創方法，並且還可以是惡性腫瘤的新治療靶標選擇參考。

癌細胞擴散轉移一直是惡性腫瘤的標誌之一，也是導致大多數癌症造成死亡的原因。癌細胞遠處轉移性擴散主要藉由血行性的，骨，腦，肝和肺等器官的微環境看起來是特別適合CTC沉降後以及誘發繼發性病變的產生。

澳大利亞醫生Thomas Ashworth於1869年首次描述了CTC，當時他發現了與原發性癌症形態相似的循環細胞。從那時起，CTC研究領域呈現爆發性增長。

目前，CTC是轉化研究的主要工具，並且越來越多地被用作具有臨床實用性的預後和藥效學生物標誌物。 CTC分析為微創性的“液體活檢”提供了機會，可以評估疾病反應，並可能評估患者治療的個體化程度。

這邊討論了乳癌之CTC研究目前面臨的挑戰包括：

i）                      鑑於其異質形態，CTC如何精確計數;

ii）                    表徵個體患者中CTC的異質性並解釋這種異質性的重要性

iii）                   如何由CTC研究確定其轉移潛力

CTC檢測技術

CTC是稀有細胞（每10毫升血液中/ 1億個白細胞和500億個紅細胞中的少數細胞）。需要高靈敏度測定的技術，使用富集CTC方法，然後表徵CTC 。

豐富技術

富集技術(Enrichment techniques)包括基於抗體，大小(size)過濾和密度梯度離心。

基於抗體的(豐)富(收)集方法

利用這些技術以具有腫瘤細胞特異性的抗體用於樣品富集。

上皮細胞粘附分子（EpCAM）是跨膜糖蛋白。許多CTC檢測技術是利用EpCAM蛋白的表達，因為這對上皮細胞癌症是特異性的。例如，CellSearch®（Janssen Diagnostics，NJ，United States）使用與磁珠偶聯的EpCAM抗體免疫磁性來檢體樣品富集，然後染色與半自動計數CTC方式。該系統已經獲得美國FDA批准，被認為這是比較新技術的該行業之黃金標準。依賴基於EpCAM抗體的CTC捕獲的許多其他CTC技術，也或多或少受到上皮標誌物的CTC表達的潛在損失而有所限制。這種情況是有機會發生，因為它們發展出更多的幹細胞樣表型和行為模式，這是由於上皮 - 間質轉化（EMT）作用發生的，如此會促進腫瘤細胞粘附、移動和隨後的內滲。 AdnaTest BreastCancer（AdnaGen，Langenhagen，Germany）使用抗EpCAM抗體和抗上皮細胞表面相關糖蛋白，粘蛋白-1（MUC-1）的抗體。這種正選擇技術也同樣有共同風險，僅會捕獲異質CTC群體的一小部分。

陰性選擇模式也會用於CTC的富集，最常見的是使用白血球標記物CD45。 CTC-iChip的陰性選擇模式通過使用白血球標記物CD45和顆粒細胞的標記物CD15免疫磁性選擇細胞，來移除血液樣本中的白血球。雖然這並未將分離的CTC限制於表達特定腫瘤標誌物的那些，但是問題在於數百萬個白血球中去純化回收的樣品和鑑定CTC有困難。

基於細胞大小的(豐)富(收)集方法

乳房之CTC是大細胞，直徑範圍為29.8至33.9mm。通過大小分離上皮癌細胞（ISET，Rarecells TM）允許通過8mm孔過濾血液來豐富地收集CTC，保留細胞形態，允許隨後的細胞學染色，例如EMT-表型或幹細胞標記。

目前還開發了這樣的裝置，其中使血液樣品中的細胞流過微觀通道，並鑒於它們的流速不同分成單獨的亞群。與正常血細胞相比，大尺寸的CTC及其較小的可壓縮結構，意味著它們會以獨特、不同的速率通過這些通道移動，因此可以從收集區域提取。這些微流體裝置中的一種是螺旋生物芯片（Parsortix），業已被證明可從全血樣品中回收高百分比的乳癌細胞，部分原因在於高度控制的流量。然而，這些複雜的微流體裝置通常容易受血液凝塊和氣泡的影響。目前正在進行臨床驗證的一項新技術是使用介電電泳（DEP）來分離CTC。包括CTC通常是電絕緣體，但是當它們在液體中施加特定的非均勻電場時它們可以被極化，因此它們充當“電介質顆粒”。在DEP裝置中，樣品中的細胞被極化，然後可以使電場強度發生細微變化，使細胞移動到收集中心。由於CTC在眾多血液細胞中具有獨特的膜特性和大小，因此它們可以被特異性極化和趨動。這種技術非常敏感，可以分離單個CTC。

密度梯度離心的(豐)富(收)集方法

通過利用它們通過粘性液體Ficoll-Hypaque或OncoQuick裝置的差異離心遷移，可以實現包括來自其他眾多血液細胞的CTC的單核細胞的分離。在此，富集基於CTC與周邊血液單核細胞相比下有更輕的浮力。該技術雖然速度很快，但它仍然可以產生具有高度白血球污染的CTC，並且難以在離心後精確分離單核層的狀況。

CTC表徵化技術

可以透過顯微鏡檢查或流式細胞術，在細胞水平上來實現CTC鑑定和表徵，或者使用RT-PCR在分子水平上進行CTC鑑定和表徵。大多數分析將CTC定義為細胞角蛋白陽性，CD45陰性的有核細胞。例如，在(豐)富(收)集後，使用CD45作為陰性標記，CellSearch®免疫熒光染色上皮標記物（細胞角蛋白8、18和19）並且半自動計數CTC。Ariol®的CTC系統也使用了細胞角蛋白表達去鑑定CTC。與依賴於上皮標誌物的(豐)富(收)集技術一樣，這些鑑定技術受到CTC中上皮標誌物表達潛在喪失的限制，因為它們在癌細胞EMT作用期間形成更多的幹細胞樣表型和行為模式。

流式細胞術可用於使用針對任何選擇的CTC表達的標誌物的抗體來量化CTC，因此能夠表徵和量化CTC的子族群。熒光原位雜交（FISH）使用熒光探針來鑑定特定的DNA序列，因此通過多重染色，該技術可用於鑑定感興趣有共表達標記的CTC。

使用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）對已經裂解細胞的血液樣品，進行CTC的分子鑑定和表徵是可行的。 經由CTC特異性mRNA的逆轉錄而產生cDNA，然後可以通過PCR以高度靈敏和自動的方式來擴增cDNA。然後可以使用該PCR反應的結果來估計樣品中CTC的數量及其表達模式。然而，由於這些CTC mRNA標記物通常在正常血液眾多細胞中以低水平方式表達，因此使用該技術鑑定CTC編號和表達確實具有挑戰性的。因此，多種mRNA標記物經常用於研究以幫助區分CTC和正常血細胞。富集後，AdnaTest BreastCancer在裂解細胞中使用HER2，MUC1和EpCAM mRNA水平來鑑定CTC陽性。 RT-PCR技術的一個重要優點就是能夠鑑定mRNA快速降解的活細胞CTC。

血液中CTC的稀有性和異質性限制了CTC技術在臨床環境中的可用性。In Vivo方法可以改善低CTC疾病中的CTC定量。正在探索處理大量循環血液的技術，例如白斑病，以便更準確地量化。此外，新型技術如Gilupinanodetector®，一種位於大型之周邊（通常是手臂）靜脈的探針，可以評估患者總血容量的約30-40％。將探針或'CellCollector'原位留置30分鐘並從周邊循環'捕獲'表達CTC的EpCAM。針對更多間充質和幹細胞樣CTC的技術也在開發中，這些CTC可能代表更具侵犯性的CTC亞群。

CTC計數作為乳癌的生物標誌物

CTC在轉移性乳癌（MBC）中的預後和預測作用

一項在轉移性乳癌患者中計數CTC的大型多中心前瞻性研究報告指出，治療前CTC可以作為無進展生存期（PFS）和總體生存期（OS）的獨立預測因子存在。該研究使用Cell-Search®對177名乳癌患者開始新的全身治療。在評估治療類型和治療幾線（第一次或後續），轉移時間，雌激素，HER2受體狀態和CTC陽性的多變量分析中，CTC陽性是PFS和OS的最強預測因子。根據一組患者，每7.5毫升血液中有5個以上的CTC被歸類為具有不良預後的'CTC陽性'患者，並且隨後被其他研究使用。一些研究支持了這些發現，CTC陽性率在31％和61％之間變化。最近對468名轉移性乳癌患者進行的前瞻性多中心研究顯示，雌激素受體（ER）陽性的CTC陽性率明顯高於ER陰性患者（p = 0.030）。本研究報導，ER陽性率為46％，HER2陽性率為37％，三陰性乳癌為36％，CTC陽性率為乳癌所有亞型的預後指標。此外，骨頭和內臟轉移患者的CTC發生率更高（p <0.001）。

CTC也可能在癌症早期偵測的癌症病況惡化中有角色。在影像中癌症病況惡化證據之前，CTC計數與影像檢查的疾病進展相關，最長可以提早7-9週偵測的癌症病況惡化。最近，將CTC計數與其他預後變數（例如年齡，腫瘤表型，內臟轉移的存在和表現狀態）相結合的列線圖，已被證實為用於估計第一線治療轉移性乳癌患者的存活率的工具。

此外，CTC計數可能對癌症治療反應具有預測作用。例如，具有高基礎值CTC計數的轉移性乳癌患者接受第一線荷爾蒙治療獲益最小，反而會從更積極的治療（例如聯合化療和化療加bevacizumab）獲得更大好處。因此，CTC可能在個體化治療和避免不必要治療的決策中發揮潛在作用。目前，CellSearch®系統是唯一經過美國FDA批准可以用於臨床環境中CTC計數的醫療設備，專門用於評估轉移性乳癌患者的治療反應。

早期乳癌（EBC）的預後作用

CTC計數在早期乳癌中的臨床應用目前尚不明確。

大多數研究是在手術切除和開始化療後的患者中進行的。在術前患者中，使用一個或多個CTC作為陽性結果，報告為CTC陽性率有5％~29％。 CTC的存在可預測早期復發，並且預測降該早期乳癌患者的總體存活率較差，但這種低計數的臨床有效性仍然是有爭論的。使用白血球去除術來篩選大量血液，結合CellSearch，已經在90％早期乳癌患者中鑑定出CTC，其數量與癌症期數階段相關。

在接受輔助化療的早期乳癌患者中，CTC計數的增加是癌症復發的預測因子。對於接受術前輔助化療治療局部晚期乳癌的患者，化療前CTC檢測是無轉移和總生存率的獨立預後因素。

CTC作為治療功效與藥效學的生物標誌物

全身治療後的CTC計數是預後的結果。在轉移性乳癌中，在化療的第二療程之前是否存在有5 個以上CTC，與癌症無進展和總體存活時間相關。 CTC計數也被證明可以預測更積極治療方案的有效與否。化療後CTC計數的變化與腫瘤影像學腫瘤有無反應和癌症無進展和總體存活時間相關，突出了CTC計數作為藥效學生物標誌物的潛在作用。研究現在探索CTC在改善患者處置方面的作用。 STIC METABREAST是一項前瞻性研究，探討CTC在指導轉移性乳癌選擇荷爾蒙和化療之間的選擇，進而是否影響癌症無進展和總體存活時間中。 SWOG S0500，隨機化的轉移性乳癌患者一線治療，在單次化療療程後沒有CTC計數減少，分別進行繼續原本一線化療或是盡早轉為另一種方案。根據2013年12月在聖安東尼奧乳癌研討會上發表的結果顯示，早期轉換沒有改善總體生存期或PFS時間。

乳癌CTC的表型表徵

原發性腫瘤和轉移性病變的HER2和ER狀態之間的差異，會發生在三分之一或更多的轉移性乳癌患者中，突出了治療期間腫瘤表型會有所演變。一些研究表明，在早期乳癌和轉移性乳癌中，同一患者的原發腫瘤和CTC的ER和HER2狀態之間存在不一致。 CTC和匹配的原發性腫瘤的基因組分析證實共享譜系，存在一些遺傳分歧，與單細胞克隆擴增導致的轉移形成一致。

在轉移性乳癌中，CTC的HER2陽性率變化很大，在27％和63％之間，取決於分離和表徵方法。高達49％的HER2陰性原發性乳癌患者同時具有HER2陽性CTC，相反，高達77％的HER2陽性原發性乳癌患者俱有HER2陰性CTC。

在GeparQuattro III期新輔助試驗的招募到早期乳癌患者中，26名患有HER2陰性原發性腫瘤而CTC陽性患者中，5名（19％）患者有HER2陽性的CTC。相反，11例HER2陽性原發性乳癌患者中，有4例患有HER2陰性的CTC。最近對HER2陰性早期乳癌患者而有HER2陽性CTC的研究，隨機分為trastuzumab或輔助化療後而無治療。 trastuzumab治療組的中位無病生存率顯著較高。 DETECT III的研究將最初HER2陰性的轉移性乳癌患者隨機分組，但有HER2陽性CTC者分別使用單獨使用標準治療與lapatinib標準治療相比。鑑於CTC的異質性，TREAT-CTC試驗隨機分配HER2陰性，CTC陽性EBC患者治療用（neo）輔助化療（不論CTC 有無HER2表達）治療候用觀察或改用trastuzumab。

目前對CTC中的ER表達的研究進行較少，但是在早期乳癌中，儘管大多數原發性腫瘤是ER陽性，但也只有大約25％的CTC是ER陽性的。與HER2表達不同，在從原發腫瘤到CTC的進化中，ER表達更常丟失或以相似的頻率獲得。然而，缺乏用於確定CTC中ER-陽性的經驗證的測定方式和缺乏檢測ER CTC表達的較大研究，限制了該發現的臨床效用。癌症幹細胞(CTCS)子集循環腫瘤細胞經歷EMT以幫助進入周邊循環。

EMT是轉錄和細胞骨架變化的多步驟過程，以獲得間質特徵，從而允許增加移動性和對細胞凋亡的抗性，從而促進侵入血管空間。轉移的發展還需要能夠自我更新並形成構成繼發性癌症的異質子細胞的細胞，這就是癌症幹細胞

。

EMT與幹細胞特性的產生相關，包括對常規治療的抗性。超過一半的轉移性乳癌患者的CTC顯示出EMT（Twist1，AKT2，P13Kalpha，波形蛋白和N-鈣粘蛋白）和幹細胞（ALDH1）的證據。 CTC上存在EMT和幹細胞標誌物與多藥抗藥基因型和治療無應答相關。然而，這些標誌物可能代表潛在的治療靶點。

CTC作為治療靶點

由於CTC的循環癌症幹細胞亞群被認為代表該癌症具有特別的侵襲性，至於侵襲性和增殖性部分，因此它們是預防轉移性擴散的高價值目標。在體內人乳癌異種移植模型中，抗CD44（幹細胞標記物）抗體減少腫瘤生長並防止化療後復發。 PAR6A，Notch1，Hedgehog，Wnt，整聯蛋白，密蛋白，酪氨酸激酶和Rho GTP酶的抑制劑，都靶向在癌症幹細胞中激活或參與EMT調節的信號傳導途徑。許多這些抑制劑，包括二甲雙胍，正在進行臨床試驗。

用於靶向一般CTC群體的更新穎的技術包括

l   在黑色素瘤中提出的血流中CTC的光聲引導光熱消融，其中靶向特異於黑色素生色團的光聲譜和

l   通過其粘附配體的表達捕獲CTC例如TNF相關的凋亡誘導配體（TRAIL）和誘導細胞凋亡。

然而，與每毫升血液中數十億個紅血球和數千個白紅血球相比，所有CTC靶向方法都受到CTC較為稀有而有所限制。

CTC和靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）

越來越多的證據表明，CTC和止血系統之間存在著密切的關係。癌細胞部分通過組織因子的過度表達促進高凝狀態，組織因子是凝血的主要起始因子。在290名轉移性乳癌患者的研究中，與沒有可檢測的CTC的患者相比，一種或多種CTC的存在者，其導致VTE發生率增加超過四倍。此外，VTE在大於或等於 5個CTC的患者中比在小魚5個CTC中更常見（p = 0.07）。在前列腺癌中，CTC計數與血漿d-二聚體具相關性，血漿d-二聚體是凝血級聯激活的終產物和標誌物。

癌症和止血系統之間的關係是共生的。組織因子通過PI3K / AKT途徑和通過促進EMT抑制錨定依賴性細胞凋亡（失巢凋亡）來輔助CTC存活。凝血酶誘導EMT（可能通過誘導TWIST表達），而直接血小板與癌細胞的相互作用通過上調蝸牛和波形蛋白誘導EMT。纖維蛋白沉積和血小板活化已經顯示有助於產生保護性“血栓斗篷(thrombus cloak)”，其保護CTC免於受到動物癌症模型中自然殺傷細胞依賴性的清除，並且可以幫助將CTC捕獲在微血管中，從而促進外滲。由活化的血小板表達的配體還在剪切力下直接幫助腫瘤細胞附著於內皮細胞。血小板整聯蛋白aIIbb3與腫瘤細胞受體結合（通過腫瘤受體如avb3），其允許腫瘤細胞在流動時附著於內皮表面。單克隆抗體對整聯蛋白的抑制降低了血小板 - 腫瘤細胞相互作用和腫瘤與內皮的粘附。腫瘤表達的CD44結合纖維蛋白並增強腫瘤血小板相互作用，允許滾動和束縛於內皮。 CTC與凝血系統的相互作用導致許多抗凝治療被研究作為轉移過程的潛在抑製劑。 TF和凝血酶的抑製劑已顯示小鼠模型中乳腺癌轉移的減少。 Heparins還通過抑制血小板 - 細胞內皮細胞相互作用來減少鼠模型中的轉移，並且可能對癌症患者的存活具有有益作用。 ALT-836是一種針對組織因子的單克隆抗體，正在進行局部晚期和轉移性實體腫瘤的第一期臨床試驗。 CTC作為VTE發展的預後標誌的作用尚待探索。

無細胞DNA（cfDNA）

在病理過程如炎症，創傷和惡性腫瘤期間，循環核酸通過凋亡和壞死細胞釋放到循環中。遺傳和表觀遺傳改變可以識別癌症患者中腫瘤衍生的cfDNA。在乳癌中，這些改變包括雜合性缺失、擴增，特別是HER2和基因突變，例如TP53和PIK3CA。與CTC一樣，原發性腫瘤HER2表達與cfDNA HER2擴增之間存在不一致，突出了該檢測方法可能識別可能從HER2直接單克隆中獲益的其他患者抗體療法。在早期乳癌患者長期隨訪中沒有轉移性疾病的證據，已經確定了與原發腫瘤相匹配的拷貝數變異的cfDNA，證明了cfDNA監測亞臨床殘留疾病的可能性。

此外，cfDNA的定量與轉移性乳癌中的轉移負荷相關。在對接受連續血液檢查的52名轉移性乳癌患者進行的一項研究中，53％的疾病惡化患者在影像診斷腫瘤惡化大約提前平均5個月，cfDNA在一個或多個連續時間點有所增加。因此，與CTC一樣，CfDNA可能具有作為治療反應的藥效學生物標誌物的潛力。

最近，連續性追蹤監測cfDNA已證明突變等位基因的代表性增加，這與轉移性乳癌患者的治療抗藥性的發展相呼應。血漿腫瘤基因組的系列分析可能具有識別與後天性抗藥性相關的新突變和個體化標靶治療的潛力。然而，cfDNA分析僅限於具有可識別突變的循環DNA，例如在先前的研究中，52名轉移性乳癌患者中只有30名具有可檢測的改變。此外，有人擔心cfDNA反映腫瘤細胞的凋亡子集而不是可行的子集，限制了其臨床相關性。

結論

儘管在計數和表徵方面存在挑戰，但CTC評估是生物標記物開發和新型治療靶向的發展性，是一個令人興奮的領域。確定CTC異質性的重要性，特別是這些細胞的幹細胞樣亞群，以及影響CTC的活力，是探討該領域臨床影響的基礎。 CfDNA評估可能為這種生物標記工具提供發展更可靠且重要的輔助手段。

陳駿逸醫師目前服務於台灣，擔任癌症中醫與西醫臨床治療醫師，著有”擊退癌疲憊 醫師該告訴你的癌後養生術”(康健出版)，專職中西醫結合癌症治療與癌友關懷之公益活動，同時熱心致力於正確癌症照護資訊之推廣與傳遞，其所創建之台中市全方位癌症關懷協會http://www.cancerinfotw.org ，乃是專業照護人員、社會賢達貢獻所學，所建構的癌症診療與照護資訊平臺。

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